做單細(xì)胞測序、流式細(xì)胞術(shù)或者細(xì)胞培養(yǎng)的都知道，真正決定實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的不是測序平臺，也不是分析軟件，而是前面的樣品前處理制備。不少實(shí)驗(yàn)人員都有過類似經(jīng)歷：組織解離完成后，細(xì)胞數(shù)量不少，但活率偏低；或者細(xì)胞團(tuán)塊很多，過濾時堵篩網(wǎng)；再或者流式檢測背景高、數(shù)據(jù)離散。很多時候，并不是后續(xù)實(shí)驗(yàn)出了問題，而是單細(xì)胞懸液制備階段沒有處理好。

　　單細(xì)胞懸液制備看起來只是把組織分散成單個細(xì)胞，實(shí)際上每一步都會影響到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的常見操作，總結(jié)幾個容易忽略卻非常關(guān)鍵的細(xì)節(jié)。

　　一、組織離體后盡快處理

　　組織樣本離體以后，細(xì)胞活性會隨著時間逐漸下降。尤其是腫瘤組織、腦組織、脾臟等活性較高的樣品，如果長時間放置在室溫環(huán)境中，很容易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加、RNA降解等情況。

　　比較穩(wěn)妥的方法，是樣本取出后立即放入預(yù)冷保存液中，并盡快進(jìn)入解離流程。如果需要運(yùn)輸，也建議全程低溫保存，盡量縮短等待時間。

　　二、組織剪切大小要均勻

　　不少人認(rèn)為有了單細(xì)胞懸液制備儀解離設(shè)備，就可以直接放整塊組織進(jìn)去。其實(shí)并不是這樣。如果組織塊太大，消化酶很難快速滲透到內(nèi)部，容易出現(xiàn)外層已經(jīng)解離，而中心仍然保持完整的情況。

　　一般建議將組織剪切成2～3毫米左右的小塊，大小盡量保持一致，這樣酶解效率更均勻，也能減少后續(xù)機(jī)械解離的壓力。

　　三、不要一味延長酶解時間

　　很多實(shí)驗(yàn)失敗后，第一反應(yīng)就是是不是酶解時間太短？實(shí)際上，時間過長同樣會影響實(shí)驗(yàn)。酶解不足，組織無法分散。酶解過度，則可能破壞細(xì)胞膜，降低細(xì)胞活率，甚至影響細(xì)胞表面抗原表達(dá)，對于后續(xù)流式檢測尤其不利。

　　因此，不同組織應(yīng)根據(jù)特點(diǎn)選擇對應(yīng)的酶種類、濃度和消化時間，不建議簡單照搬其他實(shí)驗(yàn)方案。

　　四、機(jī)械吹打力度要適中

　　組織經(jīng)過酶解后，很多人會反復(fù)用移液槍吹打，希望盡快得到更多單細(xì)胞。其實(shí)吹打次數(shù)越多，并不代表效果越好。力度過大容易造成細(xì)胞破裂，特別是免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等較脆弱的細(xì)胞，更容易受到機(jī)械損傷。

　　建議采用寬口槍頭緩慢吹打，根據(jù)組織解離程度適當(dāng)調(diào)整次數(shù)，不要為了追求數(shù)量而影響細(xì)胞質(zhì)量。

　　五、過濾步驟不能省

　　解離結(jié)束后，一定要經(jīng)過細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。很多實(shí)驗(yàn)人員覺得樣品已經(jīng)比較均勻，就直接離心。實(shí)際上，沒有解離好的組織碎塊、纖維以及細(xì)胞團(tuán)塊都會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。尤其是在流式細(xì)胞術(shù)或單細(xì)胞測序過程中，大顆粒組織容易堵塞儀器，也會增加雙細(xì)胞比例。一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇濾網(wǎng)，可以有效去除雜質(zhì)，提高單細(xì)胞純度。

　　六、離心參數(shù)不要盲目提高

　　有時候?yàn)榱俗尲?xì)胞沉降更好，有人會提高離心速度。這種做法并不推薦。不同細(xì)胞對離心力的耐受程度不同，速度過高可能造成細(xì)胞損傷，尤其是一些原代細(xì)胞和免疫細(xì)胞。建議按照實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置合適的離心速度和時間，既保證細(xì)胞回收率，又盡量減少機(jī)械損傷。

　　七、全程注意溫度控制

　　很多組織樣品對溫度變化比較敏感。除酶解階段需要恒溫外，其余步驟通常建議保持低溫操作。例如PBS、培養(yǎng)基提前預(yù)冷，離心結(jié)束后及時放回冰上，減少細(xì)胞代謝，提高活率。對于需要開展單細(xì)胞RNA測序的實(shí)驗(yàn)來說，這一點(diǎn)特別重要。

　　八、減少人為操作差異

　　實(shí)驗(yàn)室中，同一個樣品由不同人員處理，得到的結(jié)果有時差異明顯。原因就在于每個人剪切方式、吹打力度、混勻速度都不同。現(xiàn)在也有越來越多實(shí)驗(yàn)室開始使用單細(xì)胞懸液制備儀，就是希望將組織解離流程標(biāo)準(zhǔn)化。

　　單細(xì)胞懸液制備儀自動化解離設(shè)備能夠按照設(shè)定程序完成恒溫酶解、機(jī)械解離等步驟，減少人工操作帶來的誤差，對于批量樣品處理和多中心實(shí)驗(yàn)尤為有幫助。

　　九、及時檢測細(xì)胞活率

　　制備完成后，不建議直接進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。最好先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率檢測。如果發(fā)現(xiàn)活率偏低、碎片較多或細(xì)胞團(tuán)塊明顯，應(yīng)先分析原因，再決定是否繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。這一小步雖然增加了一點(diǎn)時間，卻能夠避免后續(xù)測序、流式等實(shí)驗(yàn)失敗帶來的更大損失。

　　如何提高制備的單細(xì)胞懸液質(zhì)量？

　　綜合來看，高質(zhì)量單細(xì)胞懸液通常具備幾個特點(diǎn)：

　　1. 細(xì)胞分散均勻，沒有明顯團(tuán)聚；

　　2. 活率較高，細(xì)胞膜完整；

　　3. 雜質(zhì)和組織碎片較少；

　　4. 細(xì)胞濃度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求；

　　5. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

　　想達(dá)到這些目標(biāo)，并不是依賴某一個步驟，而是整個前處理流程共同決定。從組織取材、低溫保存、組織剪切，到酶解、機(jī)械解離、過濾、離心，每一步都需要規(guī)范操作。

　　很多人認(rèn)為，單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)真正難的是數(shù)據(jù)分析。實(shí)際上，前處理才是決定實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。一份質(zhì)量穩(wěn)定的單細(xì)胞懸液，不僅能夠提高細(xì)胞活率和回收率，也能為流式細(xì)胞分析、單細(xì)胞測序、細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)提供可靠基礎(chǔ)。

　　對于樣本數(shù)量較多、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性要求較高的科研團(tuán)隊(duì)來說，建立規(guī)范的單細(xì)胞懸液制備流程，并結(jié)合自動化單細(xì)胞懸液制備設(shè)備完成標(biāo)準(zhǔn)化操作，不僅能夠減少人為誤差，還能提升整體實(shí)驗(yàn)效率。